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钙黄绿素乙酰甲酯（Calcein AM）是一种具细胞膜渗透性的活细胞荧光染料，呈绿色荧光（Ex/Em=490nm/515nm）。AM基团的存在不仅加强疏水性，使其能轻易穿透活细胞膜。而且封闭结合钙离子的分子部分，本身不发荧光。一旦进入细胞后，被细胞内酯酶水解为钙黄绿素（Calcein），能与胞内钙离子结合，产生强烈的绿色荧光。因不具有细胞膜渗透性，从而被保留在胞内。与其它活细胞染料（如BCECF AM，CFDA）相比，Calcein AM最适合用于活细胞染色探针，因细胞毒性很低，而且不会抑制任何细胞功能如增殖或淋巴细胞趋化性。由于死细胞缺乏酯酶，Calcein AM仅对活细胞进行标记，这一特征使其非常适合用来检测细胞活力和细胞的短期示踪。Calcein AM常常与碘化丙啶PI联合使用，因其仅能穿过死细胞膜的无序区域到达细胞核，嵌入细胞的DNA双螺旋区域，并产生红色荧光（Ex/Em=535nm/617nm），仅对死细胞染色。

由于Calcein AM和PI-DNA都可被490nm激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。用545nm激发，仅可观察到死细胞。结合这些特征，Calcein AM和PI经常被结合用作活细胞和死细胞的双重染色。本试剂盒就是结合Calcein AM和PI的双重染料，来进行活细胞和死细胞的双重染色标记，从而进行活细胞和死细胞水平的分析。

• 可用荧光显微镜同时观察到活细胞和死细胞。
  
• 基本上适用于任何含酯酶活性的动物细胞。
  
• 其他相似的活细胞染料比较，Calcein AM基本无毒（毒性最小）。
  
• 使用Calcein AM活性检测的实验结果十分可信，与标准的51Cr释放法所得结果一致。
  
• 本试剂盒适用于荧光显微镜、流式细胞仪、荧光酶标仪或其它荧光检测系统。
  
• 本制品足够500次200μL体系的细胞悬液进行染色。
  
• 本制品只可用于科研。

1. 从低温冰箱内取出10×Assay Buffer，根据单次用量无菌条件取出适量，用去离子水（dH2O）做10倍稀释以得到1×Assay Buffer。

2. 先将低温保存的Calcein AM溶液（4mM）和PI溶液（1.5mM）室温回温至少20min，使其充分融化。
   
   • 第一次使用时建议对储存液根据单次用量分装，特别是Calcein AM，以减少反复冻融次数。
3. 取5μL Calcein AM溶液（4mM）和15μL PI溶液（1.5mM）加入5mL 1×Assay Buffer，充分混匀。此时得到Calcein AM的工作液浓度为4μM，PI的工作液浓度为4.5μM。由于不同细胞系的最佳染色条件不同，初次实验建议做梯度实验，以确定Calcein AM和PI的最适浓度。梯度筛选的原则为使用最低的探针浓度得到最好的荧光结果。注意：染色工作液必须现配现用，并且在当天用完。

4. 对于贴壁细胞，先用细胞刮刀或者胰酶-EDTA消化细胞，之后离心收集细胞（1000rpm，3min）。对于悬浮细胞，直接离心（1000rpm，3min）收集细胞。
   
5. 去上清，用1×Assay Buffer充分清洗细胞2～3次，以充分去除残留的酯酶活性。
   
6. 用1×Assay Buffer制备细胞悬液，使其密度为10⁵～10⁶细胞/mL。
   
7. 取100μL染色工作液加入200μL细胞悬液内，混匀，37℃孵育15min。
   
   • 如果需要，可延长孵育时间至30min。
8. 荧光显微镜下使用490±10nm激发滤片同时检测活细胞（黄绿色荧光）以及死细胞（红色荧光）。另外，使用545nm的激发滤片仅能观察到死细胞。也可以直接在荧光酶标仪下使用合适的滤片进行检测。
   
9. 可以使用以下方法来优化得到两种荧光染料的最佳工作浓度。
   
   • 用0.1%皂素或者0.1～0.5%地高辛孵育细胞10min，或者用70%乙醇孵育细胞30min，从而制备死细胞；用0.1～10μM的PI溶液进行死细胞染色，以得到仅对细胞核染色，而不会对细胞质染色的最佳工作浓度
     
   • 用0.1～10μM的Calcein AM进行死细胞染色，以得到不会对细胞质染色的最佳工作浓度。然后用此浓度进行活细胞染色，去观察是否活细胞能被染色。